试剂解冻与混匀过程如下：

试剂解冻与混匀步骤

1）从冰箱中取出试剂；

2）缓慢解冻试剂；

3）轻轻颠倒以混合均匀；

4）低速离心处理。

提示：混合时需尽量避免气泡的产生，因为气泡可能会影响酶的活性及实验结果的准确性。

稀释步骤

1）若需要追踪模板，请按以下步骤进行稀释；

2）若无需追踪模板，直接使用无菌超纯水稀释cDNA或直接使用cDNA原液。

常见的荧光定量仪器为96孔反应，通常分为12列×8行。

示例说明

为指导实验，以下是基因1的检测组分单孔量：

推荐大体系配制:

HieffUNICON® ColorGPSqPCR MasterMix 10μL，根据孔数n，选择n+1或n+2作为总量（每孔18μL），配制一个大体系。

具体组分如下：

• 正向引物（10μM）0.4μL
• 反向引物（10μM）0.4μL
• 无RNA酶H2O 7.2μL
• cDNA模板 2μL（检测不同样本基因1的例子）

针对基因1的检测组分:

• HieffUNICON® ColorGPSqPCR MasterMix 220μL
• 正向引物（10μM）8.8μL
• 反向引物（10μM）8.8μL
• 无RNA酶H2O 1584μL

在加好上述溶液后，请确保管盖紧闭，用手轻轻弹击管壁，使各组分充分混合。然后将试管放入小型离心机，短暂离心1-2秒，并再次轻轻弹击管壁以防气泡，再进行瞬时离心以避免部分溶液粘附于管壁，最后置于冰或冰板上。

备注：如使用显踪剂，建议模板投入体积控制在2-5μL，以保证显踪效果；若使用cDNA母液，建议投入体积控制在2μL（反应体系的1/10）以内，以防影响扩增效果。

样品配置

针对基因1的检测组分单孔量的配置步骤:

1）配置大体系Mix为18μL，cDNA模板为2μL。

在完成加样后，应确保管盖紧闭，并再次轻轻弹击管壁以充分混合。然后放入小型离心机，短暂离心1-2秒，再次轻弹管壁，确保没有气泡，并确保试管干净无液体，最后置于96孔PCR管架上。

注意：每一枪加样时请观察是否吸入气泡，气泡的存在可能导致实验数据出现较大偏差。

上机前检查

在实验前，仔细检查每个管子，确保管盖和管身上没有记号笔染料，且管内无气泡，管壁上无液体。

仪器设置

如果采用常规程序，请设置循环步骤如下：

• 预变性：95℃ 2min 1次
• 变性：95℃ 10sec 40次
• 退火/延伸：60℃（可根据引物TM值和目的基因的长度）30sec
• 熔解曲线阶段：仪器默认设置 1次

若采用快速程序，请确认仪器是否支持快速升降温，并进行快速程序的相应设置。

数据处理

实验结束后，得到的Excel数据可根据具体品牌及型号进行处理，建议使用环亚集团·AG88的高灵敏显色示踪荧光定量预混液，确保结果的准确性与可靠性。

以下是一些推荐品牌和型号：

• Bio-Rad CFX96, CFX384, CFXConnect
• Roche LightCycler系列
• ABI/Thermo/Life的QuantStudio系列

在使用环亚集团·AG88的预混液（如Cat#11188ES，11184ES等）进行荧光定量实验时，确保选择合适的反应体系，以获得最佳的实验效果。