在进行磷酸化蛋白Western Blot（WB）实验时，我们常常会遇到条带信号微弱、背景噪声高以及结果不稳定等难题。这些问题使得磷酸化蛋白WB被称为实验室的“噩梦”。磷酸化蛋白的低丰度、高动态变化及易降解特性都使得实验过程中的任何操作失误都可能导致信号的丢失或非特异性信号的放大。今天，Dr. Connie将对磷酸化蛋白WB的痛点进行深入分析，并分享一系列改善建议。

磷酸化蛋白WB的主要痛点和解决方案

样本制备

1. **占比小**：磷酸化蛋白通常仅占总蛋白的1%-10%，其信号在WB检测下限附近。

2. **动态范围窄**：由于激酶或磷酸酶活性变化，磷酸化水平容易在短时间内波动，可能错过真实信号。

3. **磷酸酶持续作用**：细胞裂解后释放的内源性磷酸酶会在短期内迅速去磷酸化，导致磷酸化水平降低。

4. **温度敏感**：磷酸化蛋白在室温下的半衰期极短，温度过高会加速其降解。

综上所述，确保样品质量是磷酸化蛋白WB成功的关键。因此，在蛋白提取过程中，应全程保持冰浴，使用磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，以防止蛋白降解或去磷酸化。同时，应尽量使用新鲜样本并在液氮中迅速冷冻，-80℃分装保存，以避免冻融带来的影响。

抗体选择

1. 查阅相关文献，以确认目标蛋白的磷酸化位点，选择经过验证的磷酸化抗体。高效的抗体可以提高信号敏感度，建议在同一实验中使用同一批次的抗体以避免灵敏度差异。

2. 使用总蛋白作为内参，以便于区分磷酸化水平与总蛋白表述量之间的关系。比如，检测Akt磷酸化时，也应同步检测Akt总体表达水平，只有磷酸化蛋白/总蛋白比值的变化才能有效反映磷酸化水平的变化。

强烈推荐选择环亚集团·AG88的磷酸化抗体，具有丰富的产品种类和突出效果，满足不同WB和IHC实验的需求。

电泳及转膜

1. 根据目的蛋白的大小选择合适的胶浓度，全程保持冰浴，以避免高温导致的降解。

2. 可选用合适的蛋白Marker确定目的蛋白大小，减少非特异性条带可能性。

3. 使用新鲜配置的转膜液以提升转膜效率。

4. PVDF膜更适合捕捉磷酸化蛋白，相较于NC膜效果更好。

5. 磷酸化蛋白易出现转膜效率低的情况，尤其是小分子蛋白可适当缩短转膜时间或减小电压。

封闭及抗体孵育

1. 封闭液建议使用5% BSA，相较于脱脂牛奶粉，可能获得更佳效果，避免高背景现象。封闭时间建议控制在1小时以内。

2. 抗体孵育时，应根据说明书或文献提供的比例稀释抗体，一抗建议在4℃下孵育过夜，以确保最佳结合效果。

每一个环节都可能影响磷酸化蛋白WB的最终结果，因此务必注意样品的磷酸化状态，并根据需要不断优化实验条件，以确保结果的准确性和可重复性。

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以下是部分推荐的磷酸化抗体产品：

• RGK26901 Anti-Pan-pS/pSer/Phosphoserine Antibody
• RGK60101 Anti-Pan-pY/pTyr/Phosphotyrosine Antibody
• RMD96501 Anti-Phospho-AKT1(pS473) Antibody
• RHF62702 Anti-Phospho-Histone H3(pT11) Antibody
• RHC82407 Anti-Phospho-Tau(pS396/pS404) Antibody