标记定量蛋白质组学简介

环亚集团·AG88为您提供关于标记定量蛋白质组学的全面解读。标记定量蛋白质组学是一种利用化学或同位素标签对蛋白质或肽段进行标记的技术，以便在质谱分析中区分不同样本，从而实现相对或绝对定量。主流方法包括iTRAQ、TMT和SILAC等。

SILAC与iTRAQ/TMT的区别

SILAC是一种在细胞培养过程中进行 metabolic labeling 的方法，通常支持2-3重标记（使用NeuCode时最多可支持4重以上），其定量在一级质谱（MS1）水平进行。iTRAQ是一种化学同位素标记法，支持4-8重，定量在二级质谱（MS2）进行。同时，TMT也是一种同位素化学标记技术，支持10-18重，非常适合大规模、高通量研究，定量同样在二级质谱（MS2）进行。

标记定量的优势

与非标记方法相比，基于标记的定量蛋白质组学具有更高的准确性和样本间的重现性。这种方法能够减少因单独处理样本而产生的技术差异，并支持多样本分析，让研究人员在一次质谱分析中比较多个样本。

选择合适的标记定量方法

选择适合的标记定量方法应根据样本类型、实验规模和研究目标而定。如果是活细胞且需要精确定量，建议使用SILAC，因为该方法适用于动态研究，如时间进程实验或治疗反应。iTRAQ适合组织或体液样本，提供良好的灵敏度和重复性，而TMT则适合高通量研究，最多可在每次运行中分析18个样本。在选择时，还需考虑仪器兼容性、预算等因素。

iTRAQ/TMT中为何选择MS²进行reporter离子定量

在iTRAQ和TMT的实验中，所有标记肽段在MS¹水平上具有相同的质量，无法区分。因此，在MS²分析中，每个标记的肽段会释放出具有不同m/z的唯一报告离子，这样可以更精确地对每个样本进行定量。

绝对定量的可行性

基于标记的定量蛋白质组学能够进行绝对定量，但需要使用已知浓度的标准肽段或蛋白质进行校准。通过这种方法，研究人员可以生成标准曲线，并通过对比报告离子强度计算样本中目标蛋白的绝对浓度。

样本混合分析的注意事项

在同一批TMT或iTRAQ实验中，应将来源一致、处理条件明确且具有可比性的样本放在一起。例如，可以比较相同细胞或组织在“对照与药物处理”条件下的样本。避免混合来自不同组织的样本，以减少技术干扰和提高 quantification 的准确性。

解决TMT信号偏移的方法

虽然部分信号偏差可以通过数据归一化处理来解决，但如果生物背景差异过大，归一化可能会掩盖真实差异。因此，合理的实验设计和生物组别的清晰定义是至关重要的。

SILAC标记后的蛋白提取时间

SILAC标记是体内标记过程，通常需要至少传代5-6代，以确保细胞内的天然氨基酸被同位素标记的氨基酸替代。具体提取时间取决于细胞类型及其生长速度。

TMT实验样本混合均匀性的评估

在标记前后分别取样本进行SDS-PAGE定量比对，可以有效评估混合的一致性。同时，在质谱分析中监测报告离子强度也是一种有效的评估方法。

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